RPA方法的探针检测法

亲水性薄膜

工作原理要点：

1、在RPA系统中，添加特异性探针；

2、探针中引入四氢呋喃修饰位点，四氢呋喃修饰核苷酸在DNA聚合酶作用下，可以几乎100%效率实现DNA链延伸；

3、在四氢呋喃修饰位点的临近处偶链发光基团和淬灭基团；

4、当探针同靶序列结构形成双链DNA，Nfo在巡视过程中遇到四氢呋喃修饰位点则认为DNA出现损伤需要进行修复，故对探针上的该位点进行剪切，从而释放荧光基团；

5、剪切后的探针，具有游离3‘-OH，所以可以作为引物继续合成新模板；

6、使用不同的荧光探针，可以实现多重PCR检测。

试纸瓶

RPA方法胶体金层析检测法

工作原理要点：

1、同样在RPA系统中，引物5‘端标记生物素；

2、添加探针，探针同样带有四氢呋喃修饰位点，5’端带有荧光基团FAM，3‘端进行修饰，使得无法延伸；

3、当探针同由5‘端带有生物素标记的引物扩增的靶DNA产物配对时，Nfo切割探针，形成游离3‘-OH，可以作为引物继续延伸，合成子代靶DNA序列；那么子代靶DNA序列就会同时带有FAM荧光基团和生物素。

4、胶体金颗粒上标记抗FAM荧光基团的抗体；

5、NC膜上包被 C线为抗FAM的抗抗体；T线为抗生物素抗体，这样就会在T线去形成抗生物素抗体/生物素-目标靶系列-FAM/抗FAM抗体-胶体金的阳性复合物。

RPA/RAA整个反应非常速度，约30min就可以得到结果；

灵敏度可达10copies/ul；扩增引物长度30-35bp，太短引物会影响特异性、灵敏度和扩增速度；且扩增期间不需要复杂的仪器；在此基础上开发的探针法或胶体金层析法都大大简化了检测结果的使用仪器，可以更好的满足不具备分子检测条件的基层或者经济较为落后的地区。