反向PCR起初设计用于确定邻近未知区域的序列。它有助于研究基因的启动子序列；致癌性染色体重排，如基因融合、易位和转座；以及病毒基因整合。该方法之所以被称为反向PCR，是因为引物设计用于向两边延伸而不像常规PCR中朝着彼此延伸。如今，反向PCR常被用于定点突变，复制一个具有预期突变的质粒。

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在研究基因组DNA未知序列的传统工作流程中，首先进行限制性酶切消化和连接，再进行反向PCR，随后对PCR扩增子进行测序。对于gDNA消化，需选用一种限制性内切酶进行酶切，以获得长度合适且能够自我连接的片段。

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同时，选定的限制性内切酶不可剪切已知序列，从而使连接发生于侧翼未知序列之间。使用低浓度的酶切DNA片段优化连接步骤，使其倾向于自我连接而非多片段连接（即形成连环体）。

完成自我连接后，从DNA的已知区域启动反向PCR。所获得的扩增子每个末端都含有部分已知DNA序列。随后，可从末端开始对这些扩增子进行测序，检测上述已知序列的相邻区域。